Expresión y purificación de GDNF para su microencapsulación y aplicación en la enfermedad de Parkinson

Abstract

La enfermedad de Parkinosn (EP) es un proceso neurodegenerativo del sistema nervioso central que afecta a las neuronas de dopamina de la sustancia negra, núcleo mesoencefálico del control motor. La perdida en el cerebro de este neurotransmisor vital causa los síntomas de la enfermedad. La EP afecta actualmente a 200 de cada 100.000 personas y a 2 de cada 100 entre los mayores de 60 años. En España hay unos 110.000 enfermos. Además, hoy por hoy no se conoce nada que pueda prevenir o curar la enfermedad, ni existe ninguna prueba de laboratorio que permita diagnosticarla. Recentiemente se ha demostrado que el GDNF, factor neurotrófico derivado de las células gliales, es capaz de proteger las neuronas dopaminérgicas e incluso inducir la regeneración del tejido dopaminérgico dañado in vivo. El objetivo del trabajo fue diseñar y desarrolar un método de expresión y purificación de GDNF bioactivo para su posterior microencapsulación y aplicación en la enfermedad de Parkison. El sistema escogido para expresar el GDNF fue el sistema de células eucariotas de mamífero. El vector utilizado para la producción del GDNF en células eucariotas fue el pDEST26 (Tecnología Gateway de Invitrogen). Como sistema de expresión de GDNF se utilizaron las líneas celulares eucariota BHK, 293 y COS 7. Estas células fueron cultivadas en medio D-MEM (Invitrogen) complementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y Penicilina/Streptomicina (100u/ml) (Invitrogen). La transfección se realizó con Lipofectamine Plus (Invitrogen). Se analizó la expresión de GDNF a nivel de mRNA mediante PCR y a nivel de proteína mediante Western Blot del medio condicionado. Los clones positivos se crecieron en botellas de cultivo de 850 cm2 (Corning) y se realizaron ciclos de recolección del medio. Cada ciclo fue analizado por SDS-PAGE y Western Blot. Para evaluar la actividad de la proteína se ha desarrollado un ensayo de actividad en el que se demuestra la diferenciación morfológica de células PC-12 inducida por GDNF. La presencia de los receptores GFRa1 y RET, necesarios para que el GDNF ejerza su acción, fue determinada por PCR.

Las conclusiones obtenidas de este estudio son la obtención de GDNF recombinante a partir de un sistema de expresión en células eucariotas, el desarrollo de un protocolo para su posterior purificación y la obtención de GDNF recombinante biológicamente activo.